Nitrate Agar Нитратный агар	M072
Nitrate Broth Нитратный бульон	M439

 

Эти среды рекомендуют для определения нитратредуктазы у бактерий.

Рост на питательном агаре (M072), слева направо:  1. Acinetobacter calcoaceticus  2. Escherichia coli  3. Контроль (незасеянная среда)

 

Состав**:

Ингредиенты	М072 грамм/литр	М439 грамм/литр
Пептический перевар животной ткани	5,00	5,00
Мясной экстракт	3,00	3,00
Калия нитрат	1,00	1,00
Агар-агар	12,00	–
Конечное значение рН (при 25°С)	6,8 ± 0,2	7,0 ± 0,2

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 21,0 г порошка М072 или 9,0 г порошка М439 в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Разлить в пробирки. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить пробирки со средой М072 в наклонном положении.

Принцип и оценка результата:

Нитратная среда готовится по прописи, опубликованной американскими бактериологами (1). Способность восстанавливать нитрат является вариабельным признаком и может использоваться для дифференциации и идентификации бактерий, в частности представителей семейства энтеробактерий (2). Недавно международным комитетом Нитратный бульон рекомендован для подсчета Bacillus cereus бродильным методом при 30°С (3).

Неферментирующие бактерии и ряд других грамотрицательных палочек варьируют по способности к редукции нитратов. Некоторые из них способны к денитрификации с восстановлением нитрата до газообразного азота. Образование азота из нитрата является важным дифференциальным тестом для ферментирующих глюкозу грамотрицательных бактерий (4). Восстановление нитрата обычно происходит в анаэробных условиях, когда микроорганизмы «отщепляют» кислород из нитрата. Представители Enterobacteriaceae,как правило, восстанавливают нитрат до нитрита, который реагирует с сульфаниловой кислотой и N,N-диметил-1-нафтиламином, в результате чего развивается красное окрашивание (реакций Грисса). Если микроорганизм активно редуцирует нитрат, тест надо проводить раньше, пока образованный нитрит полностью не перешел в газообразный азот.

Приготовление реактивов для нитратного теста:

1.Сульфаниловая кислота: растворить 8,0 г сульфаниловой кислоты в 1000 мл 5Н уксусной кислоты.

2.Альфа-Нафтиламиновый реактив: растворить 5,0 г a–нафтиламина в 1000 мл 5Н уксусной кислоты.

Предупреждение: реактивы токсичны, требуют осторожного обращения; избегать пипетирования ртом, образования аэрозолей, попадания реактивов на кожу

Проведение теста:

Внести насколько капель каждого реактива в пробирку с испытуемой культуры. На восстановление нитрата указывает развитие красного или розового окрашивания среды. В качестве отрицательного контроля ставят тест с незасеянной средой. Если покраснения среды нет, добавьте в пробирку щепотку порошка цинка, чтобы убедиться в присутствии нитрата в среде (4). Цинк химическим путем восстанавливает нитрат, что сопровождается развитием красного окрашивания (в присутствии тест-реактива). Следует иметь ввиду, что внесение слишком большого количества цинка может привести к ложноотрицательной реакции. Нитратный тест не является решающим для идентификации. Окончательную идентификацию проводят с учетом морфологических признаков, окраски по Граму, биохимических и серологических характеристик микроорганизма.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий желтый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется полужидкая среда, соответствующая по плотности 1,2%-ному агаровому гелю (М072).

Цвет и прозрачность готовой среды:

Готовая среда имеет светло-янтарный цвет, прозрачна или слегка опалесцирует, если в пробирках формируется гель.

Кислотность среды:

При 25°С водный раствор М072 (2,1% вес/об) имеет рН 6,8 ± 0,2, водный раствор М439 (0,9% вес/об) имеет рН 7,0 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 18-24 ч при 35-37°С.

Штаммы микроорганизмов (АТСС)	Рост	Редукция нитрата
Acinetobacter calcoaceticus (19606)	Обильный	–
Enterobacter aerogenes (13048)	Обильный	+
Escherichia coli (25922)	Обильный	+
Salmonella typhimurium (14028)	Обильный	+

Ссылки:

1. Society of American Bacteriologist, ‘Pure Culture Study of Bacteria, 1944, 12 : Leaflet 11: 8.
2. Ewing, 1986, Edwards and Ewings Identification of Enterobacteriaceae, 4th ed., Elsevier Science Pub. Co., Inc., N.Y.
3. International Organization for Standardization (ISO), 1993, Draft ISO/DIS 7932.
4. MacFaddin, 1980, Biochemical Tests for the Identification of Medical Bacteria, 2nd ed., Williams and Wilkins, Baltimore.

Условия и сроки хранения:

Порошок хранить при температуре ниже +25°С. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить при температуре +2…8°С.