|
Folic Acid Casei Medium
Среда для теста на фолиевую кислоту |
M543
|
Эту среду рекомендуют для микробиологического исследования по определению фолиевой кислоты в сыворотке крови с использованием в качестве тест-микроорганизма штамма Lactobacillus casei ATCC 7469.
|
Ингредиенты
|
грамм/литр
|
|
Гидролизат казеина, свободный от витаминов
|
10,00
|
|
Глюкоза
|
40,00
|
|
Натрия ацетат
|
40,00
|
|
Калия гидрофосфат
|
1,00
|
|
Калия дигидрофосфат
|
1,00
|
|
DL-Триптофан
|
0,20
|
|
L-Аспарагин
|
0,60
|
|
L-Цистеина гидрохлорид
|
0,50
|
|
Аденина сульфат
|
0,01
|
|
Гуанина гидрохлорид
|
0,01
|
|
Урацил
|
0,01
|
|
Ксантин
|
0,02
|
|
Сорбитан-моноолеатный комплекс
|
0,1
|
|
Глютатион (восстановленный)
|
0,005
|
|
Магния сульфат
|
0,40
|
|
Натрия хлорид
|
0,02
|
|
Железа сульфат
|
0,02
|
|
Марганца сульфат
|
0,015
|
|
Рибофлавин
|
0,001
|
|
п-Аминобензойная кислота (ПАБК)
|
0,002
|
|
Пиридоксина гидрохлорид
|
0,004
|
|
Тиамина гидрохлорид
|
0,0004
|
|
Кальция пантотенат
|
0,0008
|
|
Никотиновая кислота
|
0,0008
|
|
Биотин
|
0,00002
|
|
Конечное значение рН (при 25°С) 6,7 ± 0,2
|
|
** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам
Размешать 9,4 г порошка в 100 мл дистиллированной воды и добавить 50 мг аскорбиновой кислоты. Прокипятить для полного растворения частиц. Для исследования внести по 5 мл среды в пробирки, содержащие возрастающие количества стандарта или испытуемого препарата, и довести общий объем дистиллированной водой до 10 мл. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Остудить немедленно.
Методика.
Рабочую культуру L.casei ATCC 7469 готовят путем посева уколом на среду Lactobacilli Agar AOAC (M366) с последующим инкубированием при 35-37°C в течение 18-24. Рабочую культуру хранят в холодильнике с ежемесячными пересевами. Инокулюм готовят путем субкультивирования рабочей культуры L.casei ATCC 7469 в пробирке, содержащей 10 мл посевного тест-бульона для изучения витаминов (M133) или бульона для лактобактерий (M367). Через 24 ч инкубирования при 35-37°C клетки собирают центрифугированием в асептических условиях, надосадочную жидкость сливают. Клетки ресуспензируют в 10 мл стерильной среды для теста на фолиевую кислоту, вновь осаждают центрифугированием и промывают еще раз. Наконец, отмытые клетки взвешивают в 10 мл стерильной среды для теста на фолиевую кислоту и разводят той же средой 1:100. В каждую испытуемую пробирку вносят по 1 капле полученной суспензии. В некоторых лабораториях предпочитают использовать для отмывания и приготовления инокулюма 0,85%-й раствор хлорида натрия вместо стерильной среды для теста на фолиевую кислоту.
Важно, чтобы каждое исследование сопровождалось построением стандартной кривой, так как она не может оставаться неизменной и зависит от условий автоклавирования, температуры инкубирования и т.д. Стандартную кривую строят с использованием следующих количеств фолиевой кислоты в тестовых пробирках (нг/10 мл): 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0.
Приготовление испытуемой сыворотки крови.
Дают сыворотке отделиться от сгустка крови. Чистой сухой пипеткой отсасывают сыворотку и центрифугируют ее для удаления имеющихся клеточных элементов. Стараются не допускать гемолиза эритроцитов. По 5 мл каждой сыворотки вносят в сухие чистые пробирки, куда добавляют по 25 мг аскорбиновой кислоты. До начала исследования пробирки замораживают при температуре ниже -20°С. Во время исследования размораживают сыворотку и в количестве 5 мл гомогенного образца добавляют к 45 мл буфера А для фолиевой кислоты. Инкубируют сывороточно-буферный раствор при 37°C в течение 90 мин, затем автоклавируют его при 1,1 атм (121°C) в течение 2,5 мин. Коагулировавший белок удаляют центрифугированием и переносят надосадочную жидкость в сухую чистую пробирку. Этот прозрачный раствор служит материалом для исследования на фолиевую кислоту.
Методика определения общего количества (концентрации) фолиевой кислоты в пробе.
Используют следующие объемы сывороточных экстрактов, приготовленных как описано выше: 0,5, 1,0, 1,5 мл и другие. В каждую пробирку вносят по 5 мл среды для теста на фолиевую кислоту и столько дистиллированной воды, чтобы общий объем жидкости достиг 10 мл. Затем пробирки автоклавируют при 1,1 атм (121°C) в течение 5 мин, остужают и добавляют в каждую из них по 1 капле инокулюма. После инкубирования пробирок при 35-37°C в течение 18-24 ч учитывают результат по появлению мутности. Количество фолиевой кислоты можно определить, сравнивая результат со стандартной кривой и учитывая разведение пробы.
Интерпретация результата.
Среда для теста на фолиевую кислоту готовится в соответствии с прописью Flynn et al (1), в модификации Baker et al (2) и Waters и Mollins (3).
В норме количество фолиевой кислоты в сыворотке крови составляет 99 нг/мл. Активность фолиевой кислоты может варьировать у разных лиц в зависимости от количества лабильных компонентов. Ее уровень снижается при мегалобластной анемии.
Среда для теста на фолиевую кислоту является бесфолиевой средой, содержащей все остальные питательные вещества и витамины для культивирования L.casei ATCC7469. Добавление фолиевой кислоты в возрастающих концентрациях позволяет получить рост лактобактерий, интенсивность которого измеряют турбидиметрическим методом.
Гомогенный сыпучий беловатый порошок.
Готовая среда имеет светло-янтарную окраску, прозрачная, может иметь легкий преципитат.
При 25°С водный раствор (7,5% вес/об) имеет рН 6,7 ± 0,2.
Микробиологическое исследование на фолиевую кислоту проводится с с использованием в качестве тест-микроорганизма штамма Lactobacillus casei ATCC 7469.
Через 16-18 ч инкубирования при 37°С фотометрически учитывают увеличение мутности по мере увеличения содержания фолиевой кислоты в контрольных пробирках ((нг/10 мл): 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0), выражая ее величиной абсорбции при длине волны 620 нм
1.Flynn, Williams, O’Dell and Hogan, 1951, Anal. Chem., 23, 180.
2.Baker, Herbert, Frank, Pasher, Hunter, Wasserman and Sobotka, 1959, Clin. Chem. 5, 275.
3.Waters and Mollin, 1961, J. Clin. Path., 14, 335.
Порошок хранить при температуре ниже +30°С. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить не рекомендуется.