Mueller Hinton Agar, Modified (as per CLSI for antifungal) Агар Мюллера-Хинтона (модифицированный, для определения чувствительности к антимикотикам, по стандарту CLSI)

M1825

 

  

Агар Мюллера-Хинтона (модифицированный, для определения чувствительности к антимикотикам, по стандарту CLSI) рекомендуется для изучения чувствительности дрожжей и грибков к антимикотикам диско-диффузионным методом.

 

Состав**:

Ингредиенты:	грамм/литр
Мясной настой  Казеина кислотный гидролизат  Крахмал Глюкоза Метиленовый синий Агар-агар рН (при 25ºС)	300,00 17,50 1,00 20,00 0,0005 17,00 7,3 ± 0,1

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам 

Размешать 58,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Довести до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при давлении 1,1 атм (121ºС) в течение 15 мин. Тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри.

1. Состав среды Мюллер и Хинтон был первоначально разработан как простая, прозрачная агаризованная среда для культивирования патогенных культур (1). Агар Мюллера-Хинтона (модифицированный, для определения чувствительности к антимикотикам, по стандарту CLSI) рекомендуется для диффузии антигрибковых агентов, которыми пропитаны бумажные диски, в агаровый гель, как описано в стандарте CLSI (2).

Kirby-Bauer рекомендовали агар Мюллер Хинтон для тестов определения чувствительности с использованием одного диска с высокой концентрацией (4). Комитет ВОЗ по стандартизации определения чувствительности принял агар Мюллер Хинтон для определения чувствительности микроорганизмов в связи с воспроизводимостью результатов тестирования на этой среде (3). Агар Мюллер Хинтон с добавлением 5% бараньей крови или гемоглобина был рекомендован для определения чувствительности S.pneumoniae и H.influenzae. Агар Мюллера-Хинтона (модифицированный, для определения чувствительности к антимикотикам, по стандарту CLSI) рекомендуется для изучения чувствительности дрожжей и грибков к антимикотикам диско-диффузионным методом.
Мясной настой и кислотный гидролизат казеина являются источником азотистых соединений, углерода, серы и других необходимых компонентов. Крахмал, коллоидный протектор, обеспечивает защиту от токсичных субстанций, выделяемых в среду микроорганизмами в процессе роста. Крахмал гидролизуется, образуя декстрозу, являющуюся источником энергии, как и глюкоза. Метиленовый синий позволяет получить четкие границы зоны задержки роста.

Приготовление инокулома:

1. Взять суточную культуру (24 часа при 35±20С), выращенную на среде Сабуро декстрозный агар (M063). Снять со среды пять колоний диаметром около 1 мм и суспензировать в 5 мл 0,85% NaCl.
2. Перемешать суспензию и довести ее плотность до 0,5 единиц McFarland (1х106 – 5х106 КОЕ).

Проведение исследования:

• Приготовить чашки со средой Агар Мюллера-Хинтона (модифицированный, для определения чувствительности к антимикотикам, по стандарту CLSI). Толщина слоя агара в чашках должна быть 4 мм.
• Стерильным, не токсичным хлопковым тампоном на деревянной палочке нанести суспензию микроорганизмов штрихами на поверхность агара в трех направлениях (поворачивая чашку на 600). Оставить чашку с закрытой крышкой на 5 – 15 минут для подсушивания при комнатной температуре.
• Разложить диски с антимикотиками на поверхность засеянного агара так, чтобы расстояние между центрами дисков было не менее 24 мм (не более 12 дисков на чашку диаметром 150 мм или не более 5 дисков на 100 мм чашку).
• Перевернуть чашку вверх дном и поместить в термостат при 35±20С не позднее, чем через 15 минут после наложения дисков.
• Достоверные результаты можно получить при образовании на чашках почти сливного роста культуры и равномерно круглых зон задержки роста. Если этого не наблюдается через 20 – 24 часа роста, то учитывать результаты нужно через 48 часов.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:
Гомогенный сыпучий порошок от желтого до светло-желтого цвета с легким голубоватым оттенком.
Плотность готовой среды:
Образуется среда, соответствующая по плотности 1,7%-ному агаровому гелю.
Цвет и прозрачность готовой среды:
После остывания до комнатной температуры среда прозрачна, опалесцирует и имеет янтарную окраску.
Кислотность среды:
При 25ºС водный раствор (5,8 % вес/об) имеет рН 7,3 ± 0,1.

Культуральные свойства:
Наилучший рост указанных тест-культур был получен на среде Агар Мюллера-Хинтона (модифицированный, для определения чувствительности к антимикотикам, по стандарту CLSI) при инкубации в течение 24-48 часов при 33-370С, также как и образование зон задержки роста.
Культуры, применяемые для контроля качества дисков с антимикотиками:

1. C. albicans ATCC 90028*
2. C. parapsilosis ATCC 22019*
3. C. tropicalis ATCC 750*
4. C. krusei ATCC 6258*
5. C. albicans ATCC 10231
6. S. cerevisiae ATCC 9763

* Контрольные культуры в соответствие со стандартом CLSI

Интерпретация размеров зон задержки роста

№  по  каталогу	Антимикотик	Символ	Содержание  в диске (мкг)	Диаметр зоны (мм)			Контроль
				R (мм)  или  менее	S-DD*	S (мм)  или  более	C.albicans  ATCC 90028	C .parapsilosis  ATCC 22019	C.tropicalis  ATCC 750	C.krusei  ATCC 6258	C.albicans  ATCC 10231	S.cerevisiae  ATCC 9763
SD111	Амфотерицин В	AP	100 ЕД	-	-	-	10-17	11-20	8-12	9-14	10-18	11-18
SD233	Амфотерицин В	AP	20 мкг	-	-	-	10-15	10-17	8-10	8-12	10-16	8-12
SD270	Амфотерицин В	AP	50 мкг	-	-	-	12-15	13-17	13-17	14-20	15-23	16-25
SD115	Клотримазол	CC	10 мкг	-	-	-	18-32	16-30	10-20	14-24	12-18	17-25
SD114	Флюконазол	FU	10 мкг	-	-	-	27-38	22-33	16-25	-	18-22	-
SD232	Флюконазол	FU	25 мкг	14	15-18	19	28-39	22-33	26-37	-	25-30	-
SD221	Итраконазол	IT	10 мкг	-	-	-	16-20	11-18	8-13	8-15	18-22	-
SD276	Итраконазол	IT	30 мкг	-	-	-	18-22	20-24	11-18	8-15	18-22	-
SD224	Кетоконазол	KT	10 мкг	-	-	-	20-32	14-29	17-28	10-14	18-22	-
SD275	Кетоконазол	KT	30 мкг	-	-	-	32-36	26-32	26-32	19-26	31-40	-
SD274	Кетоконазол	KT	50 мкг	-	-	-	37-45	36-44	27-34	19-26	31-40	-
SD273	Миконазол	MIC	30 мкг	-	-	-	22-26	13-17	14-20	19-26	20-27	20-28
SD272	Миконазол	MIC	50 мкг	-	-	-	26-32	23-29	14-20	19-26	20-27	20-28
SD025	Нистатин	NS	100 ЕД	-	-	-	19-27	16-25	16-21	15-20	15-23	17-25
SD271	Нистатин	NS	50 мкг	-	-	-	19-23	19-23	13-17	19-26	16-25	22-27
SD277	Вориконазол	VOR	1 мкг	13	14-16	17	31-42	28-37	-	16-25	30-40	29-38

 

S-DD* - Дозозависимая
Красным цветом выделены результаты в соответствие со стандартом CLSI.

Интерпретация размеров зон задержки роста при использовании МИК-теста
на среде Агар Мюллера-Хинтона (модифицированный, для определения чувствительности к антимикотикам, по стандарту CLSI)

 

№ по каталогу	Антимикотик	Сим- вол	Диа- пазон (мкг)	Критерии интерпретации для Candida spps			Контроль качества
				S ≤	S-DD*	R ≥	C.albicans  ATCC 10231	C.tropicali ATCC750	C.krusei  ATCC 6258	C.paraps ilosis  ATCC 22019	C.albicans  ATCC  90028
MD071	Амфотерицин В	AP	A:32-0.25 B: 0.256-0.002	Не исследовано			0.125-0.5	0.25-1	0.5-2	0.064-0.25	0.016-0.25
MD072	Флюконазол	FLC	A: 256-2 B: 2.048-0.016	8	16-32	64	0.125-0.5	1-8	-	4-16	0.5-8
MD073	Итраконазол	IT	A:32-0.25 B: 0.256-0.002	0.12	0.25-0.5	1	0.064-0.25	0.064-0.25	0.25-1	0.032-1	0.016-0.25
MD074	Кетоконазол	KT	A: 32-0.25 B: 0.256-0.002	Не исследовано			0.008-0.032	0.032-0.125	0.25-1	0.032-2	0.004-1

 

S-DD* - Дозозависимая
Красным цветом выделены результаты в соответствие со стандартом CLSI.

Литература:

1. Mueller J. H. and Hinton J., 1941, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 48:330.
2. Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibilty Testing of yeasts; Approved Guideline Second Edition M44-A2 Vol.24 No.17.
3. Present Status and Future Work, WHO Sponsored collaborative study, Chicago, Oct. 1967.
4. Bauer A. W., Kirby W. M., Sherris J. L. and Turck M., 1966, Am. J. Clin. Pathol., 45:493.

Условия и сроки хранения:

Порошок хранить при температуре ниже +30ºС. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить при температуре +2…8ºС