 |
 |
|||||
|
|
|
Всего посетителей: 3836774
|
|
 
|
Среда для теста на фолиевую кислоту
Эту среду рекомендуют для микробиологического исследования по определению фолиевой кислоты в сыворотке крови с использованием в качестве тест-микроорганизма штамма Lactobacillus casei ATCC 7469. Состав**:
** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам Приготовление:Размешать 9,4 г порошка в 100 мл дистиллированной воды и добавить 50 мг аскорбиновой кислоты. Прокипятить для полного растворения частиц. Для исследования внести по 5 мл среды в пробирки, содержащие возрастающие количества стандарта или испытуемого препарата, и довести общий объем дистиллированной водой до 10 мл. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Остудить немедленно. Принцип и оценка результата:Методика. Рабочую культуру L.casei ATCC 7469 готовят путем посева уколом на среду Lactobacilli Agar AOAC (M366) с последующим инкубированием при 35-37°C в течение 18-24. Рабочую культуру хранят в холодильнике с ежемесячными пересевами. Инокулюм готовят путем субкультивирования рабочей культуры L.casei ATCC 7469 в пробирке, содержащей 10 мл посевного тест-бульона для изучения витаминов (M133) или бульона для лактобактерий (M367). Через 24 ч инкубирования при 35-37°C клетки собирают центрифугированием в асептических условиях, надосадочную жидкость сливают. Клетки ресуспензируют в 10 мл стерильной среды для теста на фолиевую кислоту, вновь осаждают центрифугированием и промывают еще раз. Наконец, отмытые клетки взвешивают в 10 мл стерильной среды для теста на фолиевую кислоту и разводят той же средой 1:100. В каждую испытуемую пробирку вносят по 1 капле полученной суспензии. В некоторых лабораториях предпочитают использовать для отмывания и приготовления инокулюма 0,85%-й раствор хлорида натрия вместо стерильной среды для теста на фолиевую кислоту. Важно, чтобы каждое исследование сопровождалось построением стандартной кривой, так как она не может оставаться неизменной и зависит от условий автоклавирования, температуры инкубирования и т.д. Стандартную кривую строят с использованием следующих количеств фолиевой кислоты в тестовых пробирках (нг/10 мл): 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0. Приготовление испытуемой сыворотки крови. Дают сыворотке отделиться от сгустка крови. Чистой сухой пипеткой отсасывают сыворотку и центрифугируют ее для удаления имеющихся клеточных элементов. Стараются не допускать гемолиза эритроцитов. По 5 мл каждой сыворотки вносят в сухие чистые пробирки, куда добавляют по 25 мг аскорбиновой кислоты. До начала исследования пробирки замораживают при температуре ниже -20°С. Во время исследования размораживают сыворотку и в количестве 5 мл гомогенного образца добавляют к 45 мл буфера А для фолиевой кислоты. Инкубируют сывороточно-буферный раствор при 37°C в течение 90 мин, затем автоклавируют его при 1,1 атм (121°C) в течение 2,5 мин. Коагулировавший белок удаляют центрифугированием и переносят надосадочную жидкость в сухую чистую пробирку. Этот прозрачный раствор служит материалом для исследования на фолиевую кислоту. Методика определения общего количества (концентрации) фолиевой кислоты в пробе. Используют следующие объемы сывороточных экстрактов, приготовленных как описано выше: 0,5, 1,0, 1,5 мл и другие. В каждую пробирку вносят по 5 мл среды для теста на фолиевую кислоту и столько дистиллированной воды, чтобы общий объем жидкости достиг 10 мл. Затем пробирки автоклавируют при 1,1 атм (121°C) в течение 5 мин, остужают и добавляют в каждую из них по 1 капле инокулюма. После инкубирования пробирок при 35-37°C в течение 18-24 ч учитывают результат по появлению мутности. Количество фолиевой кислоты можно определить, сравнивая результат со стандартной кривой и учитывая разведение пробы. Интерпретация результата. Среда для теста на фолиевую кислоту готовится в соответствии с прописью Flynn et al (1), в модификации Baker et al (2) и Waters и Mollins (3). В норме количество фолиевой кислоты в сыворотке крови составляет 99 нг/мл. Активность фолиевой кислоты может варьировать у разных лиц в зависимости от количества лабильных компонентов. Ее уровень снижается при мегалобластной анемии. Среда для теста на фолиевую кислоту является бесфолиевой средой, содержащей все остальные питательные вещества и витамины для культивирования L.casei ATCC7469. Добавление фолиевой кислоты в возрастающих концентрациях позволяет получить рост лактобактерий, интенсивность которого измеряют турбидиметрическим методом. Контроль качества:Внешний вид порошка:Гомогенный сыпучий беловатый порошок. Цвет и прозрачность готовой среды:Готовая среда имеет светло-янтарную окраску, прозрачная, может иметь легкий преципитат. Кислотность среды:При 25°С водный раствор (7,5% вес/об) имеет рН 6,7 ± 0,2. Культуральные свойства:Микробиологическое исследование на фолиевую кислоту проводится с с использованием в качестве тест-микроорганизма штамма Lactobacillus casei ATCC 7469. Через 16-18 ч инкубирования при 37°С фотометрически учитывают увеличение мутности по мере увеличения содержания фолиевой кислоты в контрольных пробирках ((нг/10 мл): 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0), выражая ее величиной абсорбции при длине волны 620 нм Ссылки:1.Flynn, Williams, O’Dell and Hogan, 1951, Anal. Chem., 23, 180. Условия и сроки хранения:Порошок хранить при температуре ниже +30°С. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить не рекомендуется.
|