Среды для испытания антибиотиков

Antibiotic Assay Media

Среды используются в микробиологических исследованиях по определению различных антибиотиков в продуктах фармации, пищевых продуктах и др. Ниже представлен список имеющихся сред.

Antibiotic Assay Medium №36 (M290) Рост на среде без антибиотиков

Состав сред для испытания антибиотиков (грамм/литр)

Приготовление:

Размешать соответствующее количество порошка (см.таблицу) в 1000 мл дистиллированной воды. Подогреть до полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (121°С) в течение 15 мин или следовать указаниям, изложенным на этикетке соответствующей среды.

Принцип и оценка результата:

Указанные среды используются для проведения исследований с антибиотиками. Суть и детали этих исследований изложены в исчерпывающем труде Grove и Randall (1). Исследования с применением жидких сред ранее описаны Schmidt и Moyer (2). Среды для испытания антибиотиков готовятся согласно указаниям, приведенным в американской Фармакопее (3, 4) и других официальных документах (5). Среду N 19 готовят по прописи Kirshbaum и Areet (6). Применение данных сред гарантирует получение соответствующих зон задержки роста у референс-штаммов. При этом необходимо тщательно соблюдать все условия проведения исследований. Применение стандартных питательных сред является одним из важнейших условий для получения адекватных результатов.
Источниками необходимых питательных веществ и факторов роста в средах служат такие ингредиенты, как пептический перевар животной ткани, гидролизат казеина и/или папаиновый перевар соевой муки, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и др. Натрия хлорид обеспечивает необходимое осмотическое давление, фосфаты – буферность (противодействие сдвигу рН). В некоторых средах в качестве источника углерода и энергии присутствует глюкоза. Такие ингредиенты, как сульфат марганца, сульфит натрия, L-цистеин, твин-80, добавлены в некоторые среды в соответствии с питательными потребностями культивируемых микроорганизмов.

Методы исследования

1. Метод цилиндров.
Впервые метод был предложен Abraham и соавт. (7), а затем модифицирован Schmidt и Moyer (2). Суть метода заключается в том, что антибиотик диффундирует из стальных полых цилиндров, установленных вертикально на поверхность засеянного агара. В результате вокруг цилиндра формируется зона задержки роста, величина которой пропорциональна концентрации антибиотика. Обычно этот метод используют для испытания фармпрепаратов пенициллина и других антибиотиков. Для испытания применяют круглые чашки Петри размером 20 х 100 мм и полые стальные или фарфоровые цилиндры длиной 10 мм, имеющие внешний диаметр 8 мм и внутренний диаметр 6 мм (± 0,1 мм). Цилиндры должны быть абсолютно чистыми. При исследовании двухслойным методом посевной (верхний) агар, содержащий тест-культуру, надо вносить после полного затвердевания агаровой основы (нижнего слоя). В большинстве случаев для формирования нижнего слоя требуется 21 мл среды, посевного слоя – 4 мл. На 1 чашку обычно устанавливают до 6 цилиндров, на одинаковом удалении друг от друга и от края чашки.

2.Метод лунок.
В засеянном агаре специальным устройством вырезают лунки, в которые затем вносят растворы антибиотиков. Технология испытания подобна методу цилиндров.

3.Метод бумажных дисков.
Бумажные диски диаметром 9 мм пропитывают раствором антибиотика и накладывают на засеянную питательную среду. Антибиотик можно также нанести на диск, уже помещенный на питательную среду. Для данных исследований можно использовать чашки с толщиной агара 2 мм. Последующие этапы подобны описанным в методе цилиндров. В зависимости от требуемого значения рН можно использовать либо среду N 2, либо среду N 5.

4.Метод серийных разведений.
Антимикробную активность антибиотика можно определять количественно через минимальную ингибирующую концентрацию (МИК). Для этого надо использовать тест-культуру с известной чувствительностью к определенному антибиотику (величиной МИК). Из испытуемого раствора антибиотика готовят серийные (например, двукратные) разведения в одной из указанных жидких сред. Затем в каждое разведение вносят определенное количество тест-культуры. Пробирка с последним разведением, где наблюдается отсутствие мутности (подавляется рост тест-культуры), указывает на активность антибиотика в концентрации, соответствующей величине МИК.

5.Турбидиметрический метод.
Метод основан на измерении мутности в среде с определенной концентрацией антибиотика, что зависит от степени подавления роста тест-культуры. Преимущество, по сравнению с методом цилиндров, состоит в более коротком инкубировании (3-4 ч). Для испытаний используют абсолютно чистые пробирки размером 18 х 150 мм. В них готовят рабочие разведения стандартных («эталонных») препаратов антибиотиков в определенных концентрациях. Затем к 1 мл каждой концентрации добавляют 9 мл засеянного бульона. Одновременно тестируют таким же образом приготовленные растворы испытуемого препарата. Инкубирование пробирок ведут в водяной бане при соответствующей температуре в течение 3-4 ч. Затем останавливают рост добавлением в пробирку 1 капли формалина и измеряют на спектрофотометре степень прозрачности растворов. Концентрацию антибиотика в пробе определяют после сравнения с результатами испытания «эталонного» препарата.

Выбор питательной среды и референс-штаммов: данные представлены в таблице (см. ниже).