Применение питательных сред “HiMedia Laboratories Pvt. Ltd” в соответствии с ГОСТ Р 51921 – 2002 и МУК 4.2.1122-02

 

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают основные принципы организации контроля и методику проведения лабораторных исследований пищевых продуктов по выявлению в них бактерий Listeria monocytogenes.
При контроле пищевых продуктов на загрязненность патогенными микроорганизмами в СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» предусматривается новый микробиологический показатель «Listeria monocytogenes – не допускаются» в 25 г продуктов массового назначения и в 50 – 100 г для продуктов детского и специального питания.
Проведение контроля на Listeria monocytogenes позволит получить реальную картину ситуации в Российской Федерации, оценить степень загрязненности пищевой продукции и дать оценку эффективности принимаемых мер в целях обеспечения ее безопасности в плане новых и вновь возникающих возбудителей инфекций с пищевым путем передачи для здоровья и жизни человека.
1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющих контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических заключений, а также бактериологическую диагностику заболеваний с пищевым путем передачи; в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья; в организациях, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль продовольственного сырья и пищевых продуктов в процессе промышленного производства и выпуска продукции.
1.3. Методические указания являются обязательными при контроле пищевых продуктов в ходе проведения противоэпидемических мероприятий при возникновении вспышек, а также в порядке осуществления санитарно-эпидемиологического надзора.
1.4. Организация проведения контроля пищевых продуктов на Listeria monocytogenes.
Лабораторный контроль за отсутствием Listeria monocytogenes в пищевых продуктах, где нормируется этот показатель, проводится:
• в порядке надзора за соблюдением установленных требований в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов в ходе проверок изготовления и оборота пищевой продукции, оказания услуг в сфере торговли общественного питания;
• при экспертизе продукции и подтверждении соответствия требованиям нормативных документов для целей гигиенической оценки и выдачи санитарно-эпидемиологических заключений;
• при контроле за безопасностью продукции изготовителем (производственный контроль);
• в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании заболеваний.
1.5. При проведении контроля безопасности по показателю Listeria monocytogenes согласно Положению о государственной санитарно-эпидемиологической службе, утвержденному постановлением Правительства Российской Федерации от
24 июля 2000 г. №554, должен осуществляться периодический отбор образцов пищевой продукции.
1.5.1. Порядок контроля и кратность исследований должны устанавливаться в соответствии с методическими и инструктивными документами, утвержденными или согласованными в установленном порядке органами государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, при этом необходимо учитывать специфику производства, степень его эпидзначимости, материально-техническое оснащение и т.п.
Особого внимания должны заслуживать предприятия, вырабатывающие продукты детского питания, детские молочные кухни, пищеблоки детских лечебно-профилактических учреждений, стационаров для онкологических, гематологических больных, домов ребенка, родильных домов, домов престарелых и инвалидов и т.п.
При проведении текущего надзора рекомендуется минимальная периодичность выборочного лабораторного контроля пищевой продукции массового потребления – 1 раз в квартал; для детского и диетического питания – 2 раза.
1.5.2. При производственном контроле организация и периодичность лабораторных исследований продукции по показателю Listeria monocytogenes должна устанавливаться изготовителем продукции в соответствии с действующими санитарными правилами и согласовываться с учреждениями государственной санитарно-эпидемиологической службы по месту расположения предприятия-изготовителя.
1.5.3. Контроль пищевых продуктов по показателю Listeria monocytogenes с целью гигиенической оценки для выдачи санитарно-эпидемиологических заключений и подтверждения соответствия установленным требованиям при проведении экспертизы осуществляется в уполномоченных лабораториях центров госсанэпиднадзора или других организаций, аккредитованных в установленном порядке.
1.6. В пищевых продуктах, предназначенных для непосредственного употребления в пищу, в отношении которых отсутствуют микробиологические нормативы или данные о возможности выделения Listeria monocytogenes, контроль Listeria monocytogenes не проводится, однако в случае заболеваний людей и/или нарушений в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов образцы таких продуктов должны быть направлены на лабораторное исследование.
1.7. Организация лабораторных исследований на Listeria monocytogenes.
Допускается организация лабораторных исследований путем их поэтапного выполнения в лабораториях учреждений госсанэпидслужбы различных уровней. При отсутствии возможности идентификации выделенных культур последние могут быть переданы в лаборатории, располагающие соответствующей материально-технической базой и квалифицированным персоналом, для выдачи окончательного результата.

2. Сущность метода

Методические указания содержат описание метода выявления бактерий Listeria monocytogenes, основанного на высеве определенного количества продукции в жидкие селективные среды, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на агаризованных дифференциально-диагностических средах. Принадлежность выделенных культур к Listeria monocytogenes определяется по биохимическим, морфологическим и другим свойствам.
Метод выявления L. monocytogenes в пищевых продуктах основан на применении специальных селективных и дифференциально-диагностических сред. Селективность сред по отношению к сопутствующей микрофлоре обеспечивается включением в их состав хлорида лития, акрифлавина, циклогексимида, налидиксовой кислоты, полимиксина или других антибиотиков. Внесение эскулина и цитрата аммония железа позволяет подтверждать наличие листерий по почернению среды за счет гидролиза эскулина в присутствии ионов Fe+. Подтверждающие тесты родовой и видовой идентификации включают окраску по Граму, определение подвижности на агаризованных средах типичных по физиологическим и морфологическим признакам культур, их способности восстанавливать нитраты до нитритов, сбраживать рамнозу, ксилозу и маннит, способности к гидролизу лецитина, а также определение наличия бета-гемолиза на кровяном агаре и дифференциацию L. monocytogenes от других гемолизирующих листерий в САМР-тесте с контрольными штаммами Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi.
При необходимости для выявления L. monocytogenes в пищевых продуктах проводится постановка реакции нарастания титра фага (РНФ).
Предлагаемый метод обнаружения L. monocytogenes, гармонизированный с Международным стандартом ISO 11290-111996, предусматривает определение наличия или отсутствия L. monocytogenes в нормируемой массе продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 “Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов”, выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двуклассовой системе.

5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа

5.1. Общие положения по отбору и подготовке проб

РОтбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26669-85 “Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов”, МУК4.2.577-96 “Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов” ГОСТ Р 51446 (ИСО 7218-96), а также в соответствии с действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов.
Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и минимально вдвое превышают аналитический образец. Из точечных проб составляют навеску массой 25°0,1 г (50-100 г – для продуктов детского, лечебного и специализированного питания).
От продукции в потребительской таре в мелкой фасовке пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем, чтобы количество было достаточным для проведения анализа.
От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или неупакованной пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.
Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду. При этом от образца отбирают несколько точечных проб из разных мест, которые измельчают и перемешивают, из них составляют навеску 25 г.
Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры внутри продукта 0-(-1) °С; продукты, содержащие жиры (сливочное масло, мороженое) нагревают до температуры 40-45°С и перемешивают.
Отобранные образцы перемешивают и измельчают или доводят до однородной консистенции по ГОСТ 26669, из измельченной суспензии составляют навеску необходимой массы.
При посевах высококислотных или щелочных (с рН ± 6 или ±7,5) жидких и твердых продуктов для предовращения снижения рН питательных сред на 0,5 и более, рН продукта перед посевом доводят до (7,0±0,2) по ГОСТ Р 50480.

5.2. Отбор и подготовка проб молока, молочных продуктов, сыров, мороженого

Отбор и подготовку проб продуктов проводят согласно ГОСТ 3622-68 “Молоко и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию” и 9225-84 “Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа”.
Кисломолочные продукты, сыр, творог, творожные изделия и пастообразные продукты тщательно измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и подвергают нейтрализации, масло сливочное и мороженое растапливают до сметанообразной консистенции.

5.3. Отбор и подготовка проб мяса, мясных полуфабрикатов, мяса птицы и птицепродуктов, колбасных изделий и других мясопродуктов.

Отбор и подготовка проб мяса, субпродуктов, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясных продуктов проводят по ГОСТ 21237 «Мясо. Методы бактериологического анализа», ГОСТ 4288 «Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса», ГОСТ 9958, ГОСТ 9792 «Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц».
Массу навески отбирают в соответствии с п. 6.1.
Отбор и подготовку проб мяса птицы, субпродуктов и птичьих полуфабрикатов проводят по ГОСТ Р 50396.0 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям».

5.4. Отбор и подготовка проб плодоовощной продукции

Отбор и подготовку к анализу проб плодоовощной продукции проводят согласно ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26373 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб», кроме подготовки к анализу проб поверхностно контаминированных и пюреобразных продуктов. Для поверхностно контаминированной и быстрозамороженной плодоовощной продукции подготовку проводят согласно «Инструкции по микробиологическому контролю быстрозамороженной плодоовощной продукции» (МЗ СССР 29.09.89, прил. 1, п. 1.3). Для анализа поверхностно контаминированной продукции готовят суспензию добавлением к навеске массой (100±30) г, отобранной из трех единиц тары или фасовки, 0,1%-ного пептонно-солевого раствора в количестве, равном массе навески. При этом 1 см3 полученной суспензии оценивают как 1 г из трех единиц тары или фасовки и готовят объединенную пробу массой в соответствии с п. 6.1.

5.5. Отбор и подготовка проб рыбы, нерыбных объектов промысла и продуктов, вырабатываемых из них

Отбор и подготовку проб проводят согласно «Инструкции по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских беспозвоночных» № 5319-91 от 22.02.91 и ГОСТ 7631-85 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний».
Отбор проб свежей, охлажденной и мороженой рыбы проводят от 2 точечных образцов, мышечная ткань в которых составляет не менее 25 г по ГОСТ 7631-85. Из каждой точечной пробы стерильным инструментом вырезают спинные мышцы с кожей, перемешивают и отвешивают 25 г, затем измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и гомогенизируют в 225 см3 среды накопления.

5.6. Продукты детского, лечебного питания и их компоненты

Отбор и подготовку проб продуктов детского, лечебного питания и их компонентов проводят согласно МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».
Отобранные пробы продуктов перед исследованием тщательно перемешивают, кисломолочные продукты нейтрализуют (на 10 см3/г исследуемого продукта или его первого разведения для сухих кисломолочных продуктов, напитка или закваски добавляют 1,0 см3 стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией 100 г/см3. Сыр, творог, творожные изделия и пастообразные продукты тщательно измельчают и нейтрализуют. Топленое масло и молочный жир растапливают при температуре 40-45°С и перемешивают до получения однородной эмульсии.

6. Проведение анализа

6.1. Подготовленную в соответствии с п. 5. навеску исследуемого продукта (гомогената, смыва с поверхности) в количестве 25 г (см3) вносят в одну из сред для первичного обогащения (М1083R – Основа бульона Фрейзера с добавкой: Селективная добавка Фрейзера FD125I) в количестве 225 см3 (по п.п. 3.3.2.2., 4.2.3.1.). При необходимости анализа других масс продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:9 по объему.
Посевы термостатируют при 37°С в течение (24±2) ч. При росте листерий на средах предобогащения, содержащих эскулин и цитрат железа аммонийного, наблюдается почернение среды за счет гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета. На других средах почернения не отмечается.
6.2. После термостатирования продукта в среде для первичного обогащения (М1083R – Основа бульона Фрейзера с добавкой: Селективная добавка Фрейзера FD125I) 0,1 см3 суспензии пересевают в 10 см3 одной из жидких сред для вторичного обогащения (М1083R – Основа бульона Фрейзера с добавкой: Селективная добавка Фрейзера FD125I) по п.п. 3.3.2.2., 4.2.3.2. Посевы термостатируют при температуре (37±1)°С в течение 48 ч. В средах с эскулином отмечают почернение как признак возможного присутствия бактерий рода Listeria.

Для выделения и идентификации Listeria monocytogenes (без проведения указанных ниже исследований) можно использовать хромогенные среды:

1. M1540 L. mono Differential Agar Base (Основа дифференциального агара для листерий);
2. M1552 L. mono Confirmatory Agar Base (Основа диагностического агара для листерий).

6.3. Из пробирок после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, и в т.ч. почернения, делают пересев по 0,1 см3 на поверхность двух чашек Петри с одной из агаризованных дифференциально-диагностических сред (М1145 – Основа Оксфордской среды для листерий с добавкой: Оксфордская добавка для листерий FD071 или М1064 – Агар для идентификации листерий с добавкой: Селективная добавка для листерий FD061) по п.п. 3.3.2.3., 4.2.4., 4.2.5. Посевной материал растирают стерильным шпателем. Допускается проводить пересев петлей штрихом. Чашки со средами предварительно подсушивают.
Посевы термостатируют при температуре (37±1)°С в течение 24-48 ч.
6.4. Проведение анализа без этапа вторичного обогащения. При посеве продуктов с низким исходным уровнем микробной контаминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде (помутнение, почернение и др.) допускается проводить пересев на чашки с агаризованными дифференциально-диагностическими средами (М1145 – Основа Оксфордской среды для листерий с добавкой: Оксфордская добавка для листерий FD071 или М1064 – Агар для идентификации листерий с добавкой: Селективная добавка для листерий FD061) сразу после этапа первичного обогащения по п. 6.2.
6.5. При отсутствии роста на чашках с дифференциально-диагностическими средами типа Оксфордского агара и PALCAM-агара анализ прекращают и дают заключение об отсутствии L. monocytogenes в исследованной пробе продукта.
6.6. При обнаружении характерного роста на чашках отбирают 3-5 колоний для их дальнейшего изучения.
На средах типа PALCAM-агара через 24 ч инкубирования листерии формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5-1,0 мм, иногда с черным центром. Через 48 ч колонии диаметром 1,0-2,0 мм приобретают зеленую окраску с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая микрофлора (бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus) образуют желтые колонии за счет ферментации маннита.
При появлении сплошного роста листерий производят пересев бактериологической петлей из зон наибольшего почернения среды штрихами на 2-3 чашки Петри с селективной дифференциально-диагностической питательной средой (Оксфордский или PALKAM-агар) для получения изолированных колоний. Посевы термостатируют аналогично п. 6.3.
6.7. Отобранные характерные колонии, подозрительные на принадлежность к Listeria monocytogenes, пересевают на среду TSYEA (M1214 Дрожжевой триптон-соевый агар) по п. 3.3.2.1. или 4.2.2. для получения изолированных колоний, которые подвергают дальнейшему изучению. Посевы термостатируют при температуре 30°С в течение 24 ч.

6.8. Идентификация выделенных культур.

Для определения принадлежности выделенных микроорганизмов к роду Listeria полученные на средах культивирования чистые культуры микроскопируют по Граму, определяют наличие у них каталазы, подвижность (M1215 Среда для определения подвижности листерий) при двух температурах инкубирования (22°С и 37°С), способность к ферментации маннита (M1264 Бульон для дифференциации листерий или M284D Основа бульона с бромкрезоловым пурпурным для листерий) и ставят реакцию нитрат-редукции (M439 Нитратный бульон).
6.8.1. Окраска по Граму (K001). Бактерии рода Listeria являются грам-положительными тонкими короткими палочками, спор не образуют.
6.8.2. Каталазную активность культур определяют в соответствии с ГОСТ 30425 по способности каталазы разлагать перекись водорода с выделением пузырьков газа. Реакцию ставят с охлажденной до комнатной температуры суточной культурой на стерильном предметном стекле. Изолированную колонию, взятую с поверхности питательной среды, растирают на стекле и пипеткой наносят каплю 3%-ного раствора перекиси водорода. Если через 30-60 с на стекле появляются пузырьки газа, то считают результаты реакции положительными. Параллельно ставят контрольную пробу.
Бактерии рода Listeria являются каталазоположительными.
6.8.3. Подвижность культур определяют посевом уколом в среды (M1215 Среда для определения подвижности листерий) по п. 3.3.2.3. и 4.2.8. и инкубированием при двух температурах (25°С и 37°С) в течение 48-72 ч.
Бактерии рода Listeria подвижны при 20-25°С (образуют характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик) и неподвижны (или слабоподвижны) при 35-37°С.
6.8.4. Для определения способности сбраживать углеводы культуры пересевают на пестрый ряд в среды Гисса по п.п. 3.3.2.3 (M1264 Бульон для дифференциации листерий или M284D Основа бульона с бромкрезоловым пурпурным для листерий) или 4.2.9. Посевы термостатируют до 7 дней при 37°С, наличие ферментативной активности в отношении углеводов определяют по изменению окраски сред за счет образования кислоты.
Большинство бактерий рода Listeria не утилизируют маннит (за исключением L.grayi и L.grayi subsp. murrayi).
6.8.5. Постановку реакции нитрат-редукции проводят по ГОСТ 10444.8-88. Бактерии рода Listeria не восстанавливают нитраты до нитритов (за исключением L.grayi и L.grayi subsp. murrayi).
Обнаружение в посевах грамположительных коротких тонких палочек, каталазоположительных, не восстанавливающих нитраты до нитритов, не утилизирующих маннит, подвижных при 25°С и неподвижных при 37°С, указывает на принадлежность выделенных на дифференциально-диагностических средах культур с характерной морфологией к роду Listeria.
Для подтверждения принадлежности выделенных листерий к виду L.monocytogenes определяют способность к ферментации рамнозы и ксилозы (M1264 Бульон для дифференциации листерий или M284D Основа бульона с бромкрезоловым пурпурным для листерий), наличие лецитиназной (M1457 Основа лецитиназного агара для листерий) и бета-гемолитической (М144 Основа колумбийского кровяного агара) активности и проводят постановку КАМП-теста (САМР-test). Дифференцирующие признаки видов рода Listeria указаны в табл. 1.
Для видовой дифференциации выделенных культур листерий допускается использовать биохимические тест-системы (HiListeria Identification Kit KB012 и HiMotility Biocemical Kit for Listeria KBM003). При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.

 

 

Таблица 1

Признак	L.monocy- togenes	L.ivanovii	L.seeligeri	L.innocua	L.grayi	L.welshimeri
Ферментация: маннита	-	-	-	-	+	-
ксилозы	-	+	+	-	-	+
рамнозы	+	-	-	+/-	+/-	+/-
Бета-гемолиз	+	+	+	-	-	-
КАМП-тест Усиление гемолиза около штриха: Rhodococcus equi	-	+	-	-	-	-
Staphylococcus aureus	+	-	+	-	-	-
Лецитиназная активность:	+	+	-	-	-	-

 

6.8.6. Наличие способности ферментировать рамнозу и ксилозу – определяют аналогично п. 6.8.4. Бактерии L. monocytogenes утилизируют рамнозу с образованием кислоты и не утилизируют ксилозу.
6.8.7. Бета-гемолитическую активность исследуемых культур определяют по образованию зон просветления за счет растворения эритроцитов вокруг колоний при посеве на поверхность кровяного агара, приготовленного с добавлением стерильной дефибринированной крови барана или кролика. Посевы на кровяном агаре (п.п. 3.3.2.3, 4.2.6) термостатируют при 37°С в течение 24 ч.
Listeria monocytogenes обладают бета-гемолитической активностью (образуют узкие четкие зоны просветления вокруг колоний).
6.8.8. Постановку КАМП-теста проводят для дифференциации L. monocytogenes от других видов листерий, обладающих гемолитической активностью.
Для проведения теста 2-3-суточные культуры гемолитических штаммов Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi засевают на кровяной агар (М144 Основа колумбийского кровяного агара) с эритроцитами барана двумя параллельными штрихами на расстоянии 5–5,5 см, как показано на рис. 1

 

Рис. 1. S – посев Staphylococcus aureus; R – посев Rhodococcus equi.

 

 

Между вертикальными штрихами St. aureus и Rh. equi. засевают параллельными штрихами исследуемые культуры листерий на расстоянии друг от друга не менее 1 см и от вертикальных штрихов – 0,5 см. В качестве контрольных используют тест-штаммы L.monocytogenes и L.ivanovii. Инкубацию проводят 24 ч при 37°С. Отмечают форму и размеры зон гемолиза около вертикальных штрихов роста стафилококка и родококка.
Listeria monocytogenes дает расширение зоны гемолиза около штриха St. aureus (положительный КАМП-тест) и имеет отсутствие изменений зоны гемолиза рядом со штрихом Rh. equi (отрицательный КАМП-тест).

6.8.9. Для определения лецитиназной активности применяют среду M1457 Основа лецитиназного агара для листерий.

6.9. Учет результатов.

Результат оценивают по каждой исследованной пробе отдельно. В образце продукта констатируют присутствие Listeria monocytogenes, если при посеве на селективные среды выделены короткие не спорообразующие грамположительные палочки каталазоположительные, подвижные при 25°С и неподвижные при 37°С,
утилизирующие эскулин, сбраживающие с образованием кислоты рамнозу и не сбраживающие маннит и ксилозу, не восстанавливающие нитраты до нитритов, обладающие бетагемолитической активностью, дающие положительную реакцию в КАМП-тесте со Staphylococcus aureus и отрицательную – с Rhodococcus equi, проявляющие лецитиназную активность.

Результаты выявления Listeria monocytogenes в определенной навеске продукта записывают:

«Listeria monocytogenes обраружены в 25 г (см3) (в 50–100 г – для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта»

«Listeria monocytogenes не обнаружены в 25 г (см3) (в 50–100 г – для продуктов детского, лечебного и специального питания) продукта»

Результат оценивают по каждой пробе отдельно.